什么是PASS技术

平行等位基因特异性序列检测技术（Parallel Allele－specific  Sequencing，PASS）是一种基于固相PCR反应、检测病原微生物基因组序列中单个碱基的突变的新技术，其工作原理是将待测DNA或逆转录后cDNA与聚丙烯酰胺制备成混合液，形成凝胶后，进行胶内PCR反应，产物积聚到单个DNA模板附近并在扩增点形成清晰的斑点；用不同荧光素标记单核苷酸，引物进行单核苷酸延伸可掺入不同颜色标记的碱基，然后通过扫描成像区分出颜色不同野生型和突变型。通过多次单碱基延伸反应，PASS技术可以检测单个分子内多个突变位点。

PASS技术不但能敏感的检测出DNA模板上的多个突变位点，还可通过平行分析，判断同一基因组中不同突变位点的存在，进行突变位点的连锁分析，并能用于大多数亚型和重组体的检测。因此，适用于病毒群中低比例多重耐药基因的检测。

PASS技术检测病毒耐药基因的优势在于：

（1）敏感性高：能检出病毒群中万分之一、甚至千万分之一的耐药突变基因；

（2）效率高：能同时分析单个样本中的数千个病毒基因组；

（3）适用范围广：不受病毒重组或者重采样的影响；

（4）获取信息全面：能分析耐药突变位点是否发生在同一基因组中，进行连锁分析。

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什么是连锁分析

PASS技术能分析耐药突变位点是否发生在同一基因组中，进行连锁分析。

PASS技术通过固相PCR反应荧光成像区的平行分析，能判断不同突变位点是存在于同一基因组中或是不同基因组中，即突变位点的连锁分析。

在进行病毒耐药基因检测时，分析不同耐药突变位点是否存在于一个基因组中，进行耐药位点的连锁分析，这对于抗病毒治疗之前的药物选择及抗病毒治疗过程中优化治疗方案和预测治疗效果极为重要。

一般情况下，同一药物的耐药是由多个耐药突变位点的存在造成的，而不同耐药位点的组合对抗病毒药物的耐药存在很大的不同，因此、对病人进行详细的耐药突变位点连锁分析并准确地测定不同耐药病毒群（携带一个或多个耐药突变位点的病毒）在体内的分布情况将对选择最佳药物和防止耐药的产生有着重要的意义。

PASS技术与其他耐药检测方法的比较

PASS技术具有高敏感性、检测位点多、信息全面的优势。

目前，PCR产物直接测序法（direct PCR sequencing）可用于检测耐药突变位点，它是通过PCR扩增病毒有关基因片段后，直接测定PCR产物的基因序列，分析所有已知和可能的耐药突变位点；是目前公认的基因耐药检测的“金标准”，但是该方法检测敏感性低，只能检出存在于整个病毒准种池中20％以上的耐药病毒株，不能发现低比例耐药株，并且不能确定多个耐药突变位点在同一病毒基因组的组合情况。

实时荧光PCR方法（real-time PCR）能敏感、快速准确检测到已知耐药突变位点，可以检测<1%的耐药病毒群, 但每次仅能检测一个耐药突变位点。目前国内有可以检测HBV 4个位点的试剂盒，无法分析所检测到的耐药突变位点在同一基因组中的相互关系（linkage analysis）。

PASS技术同目前常用的直接测序法和实时荧光PCR法三种方法的比较见下表。

PASS技术在乙肝耐药检测上的应用

我们引进PASS技术，在世界上首次应用于乙肝耐药基因的检测。

HBV感染呈世界性流行，据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过HBV，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌 (HCC)。

乙肝抗病毒治疗是目前公认为可能改变乙肝患者预后的最有效的治疗方法，而随着长期服药，治疗时间的延长，近年耐药问题凸显，给临床治疗带来很大困扰。

目前的耐药检测方法在检测敏感度和耐药检测方面都存在明显的不足。敏感而信息全面的耐药检测方法对于能否在耐药早期及时察觉并采取有效地治疗干预具有重要意义。

我们引进平行等位基因特异性序列检测技术（Parallel Allele-specific Sequencing, PASS），在世界上首次应用于乙肝耐药基因的检测（见下图），建立了乙肝高敏感、多重耐药连锁分析的检测方法，并通过与首都医科大学附属北京佑安医院合作，共同组建“国际抗病毒药物敏感性研究中心”，应用该检测方法在乙肝人群中开展抗病毒治疗中的耐药情况监测。

PASS技术应用于乙肝的耐药检测结果

注：上图显示同一个HBV标本进行四个不同耐药位点的连锁分析结果，绿色代表野生型，红色代表突变型。 在A181T位点，该病人仅携带低比率耐药突变毒株(图a)。在M204V位点，该病人体内绝大多数病毒均含有该耐药突变位点(图b)。 在L80V位点, 耐药突变位点没有被检测到(图c)。在T184G位点，该病人体内绝大多数病毒携带该耐药位点突变（图d）。 箭头表示在同一HBV基因组的A181T耐药突变, M204V耐药突变，L80V突变野毒型和T184G耐药突变。上述结果显示发生在同一个病毒基因组上的A181T，M204V和T184G突变位点可很容易地用PASS技术检测到。

耐药基因检测技术服务

耐药基因检测位点说明

 耐药基因检测样本说明

1、免费设计引物；

2、送样须知：血清或血浆样品采样后立即在低温下（-20℃或-70℃）保存的样品，无反复冻融。我们不接受您提供的RNA/cDNA样品，除非您能充分证明所提供RNA/cDNA是高质量的。

3、结果提交：实验报告一份，剩余样本。

联系人：吴云

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