液滴式数字PCR系统

一、国内外研究应用进展

数字PCR 是近年来迅速发展起来的一种定量分析技术。与传统qPCR技术不同的是数字PCR 不依赖于扩增曲线的Ct进行定量，不受扩增效率的影响，也不必采用看家基因和标准曲线，具有很好的准确度和重现性，可以实现绝对定量分析。目前，已有Fluidigm、 Bio-Rad 、Raindance、Life等几家公司相继推出了数字PCR 产品，这些产品已经在单细胞分析、癌症早期诊断和产前诊断等研究领域显示出巨大的技术优势和应用前景。其中Raindance公司的液滴式数字PCR系统是基于油包水的原理，而其他产品则多采用的是微流控芯片技术。

同传统PCR以及qPCR相比，在扩增前，液滴式数字PCR系统能够将PCR反应体系快速、均一地制备成1000万个皮升大小的油包水液滴，实现每个液滴中最多含有1个模板或者不含模板，确保实现真正的单分子扩增, 扩增完成后对包含有PCR扩增产物的液滴进行计数，就可以直接得到DNA模板分子数，实现绝对定量。文献报道微滴式数字PCR 具有非常高的敏感性，可以实现1:200,000 的突变频率筛查。此外，通过优化反应条件，可以同时开展多个靶分子的定量检测，这为我们扩大检测靶标提供了选择。自从数字PCR开发以来，它的技术优势主要体现在以下领域：

1）稀有变异检测

2）拷贝数变异

3）无标准品情况下的核酸定量

4）与二代测序整合

二、该平台在研究所的作用和意义

北京市肝病研究所，为一所市属公益性科研院所，旨在进一步拓宽肝病的研究领域，加快肝病防治工作的进程，减少肝脏疾病的发生，利用佑安医院的特色病种，将临床治疗与基础研究紧密结合起来，创建一支创新、发展的科研团队。研究所液滴式数字PCR系统可以用于治疗后HBV、HCV、HIV患者体内病毒核酸的绝对定量，准确的低拷贝检测能力对于病毒性肝炎患者的临床治疗会提供良好的支持。根据已知的肿瘤相关位点检测panels，可以开展肝脏肿瘤患者体内相关突变定量检测，相比测序法，数字PCR具有灵敏性高、操作简单、能够定量等优点。此外，数字PCR还可以用于对一些尚没有定量标准品的病原体的定量检测。

三、诊断和科研用途

研究所液滴式数字PCR系统可以与现有的二代测序系统，包括Ion Torrent、PGM相结合。第一、在测序前，首先利用液滴制备系统将靶核酸制备成单分子，进而进行测序，以发现单基因水平的序列特征。第二、对于混合基因组中含量较低的核酸分子，通过制备成单分子测序，能够大大提高其敏感性和针对性。

对于已经发现的核酸分子靶突变位点，可以通过结果数字PCR，利用其高灵敏性、操作方便的特点，为稀有变异检测技术临床应用提供条件。例如血浆游离循环肿瘤DNA（ctDNA）用于肿瘤诊断具有良好的前景。作为一种无创的检测方法，能够真实的反映实体瘤组织中的基因突变图谱与频率，是治疗效果的评估及治疗后临床随访的重要监测指标。文献报道液滴式数字PCR系统可以实现1:200,000 的突变频率筛查并且通过优化反应条件，可以同时开展多个靶分子的绝对定量检测，为一次同时检测多个靶标提供了选择。

由于数字PCR的定量可以不依赖与已有的标准品，因此为特殊病毒、细菌等病原体的定量检测提供了可能。

四、最近几年发表的与此相关的文章

Bian X, Jing F, Li G, et al. A microfluidic droplet digital PCR for simultaneous detection of pathogenic Escherichia coli O157 and Listeria monocytogenes.BiosensBioelectron. 2015 Jul 10;74:770-777.

Mu D, Yan L, Tang H, Liao Y. A sensitive and accurate quantification method for the detection of hepatitis B virus covalently closed circular DNA by the application of a droplet digital polymerase chain reaction amplification system.BiotechnolLett. 2015 Jul 18.

Yu M, Carter KT, Makar KW, et al.MethyLight droplet digital PCR for detection and absolute quantification of infrequently methylated alleles.Epigenetics. 2015 Jul 17:1-7

Usher CL, McCarroll SA. Complex and multi-allelic copy number variation in human disease. Brief Funct Genomics. 2015 Jul 9.pii: elv028.

Mangolini A, Ferracin M, Zanzi MV, et al.Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR.Biomark Res. 2015 Jun 6;3:12.

Ferracin M, Lupini L, Salamon I, Absolute quantification of cell-free microRNAs in cancer patients.Oncotarget. 2015 Jun 10;6(16):14545-55.

Gutiérrez-Aguirre I, Rački N, Dreo T, et al. Droplet digital PCR for absolute quantification of pathogens.Methods Mol Biol. 2015;1302:331-47.

Kinugasa H, Nouso K, Tanaka T,et al. Droplet digital PCR measurement of HER2 in patients with gastric cancer.Br J Cancer. 2015 May 12;112(10):1652-5. 

Zhang BO, Xu CW, Shao Y, et al.Comparison of droplet digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring EGFR gene mutation.ExpTher Med. 2015 Apr;9(4):1383-1388. 

Malatinkova E, Kiselinova M, Bonczkowski P, et al. Accurate quantification of episomal HIV-1 two-long terminal repeat circles by use of optimized DNA isolation and droplet digital PCR.J ClinMicrobiol. 2015 Feb;53(2):699-701. 

Taly V, Pekin D, Benhaim L, et al. Multiplex picodroplet digital PCR to detect KRAS mutations in circulating DNA from the plasma of colorectal cancer patients. Clinical chemistry 2013;59:1722-1731.

五、研究所可提供的临床和科研服务项目

（一）临床服务项目

1.肝癌患者血浆游离循环肿瘤DNA（ctDNA）检测

2.外周血中特异核酸片段定量检测，例如cccDNA等

3.特殊病毒、细菌等病原体的定量检测

（二）科研用途

1.基因不稳定性分析

2.肿瘤早期标志物研究

3.产前诊断

4.基因组DNA 甲基化位点的检测

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