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【佑安学术】创新,北京佑安医院任锋科研团队利用CRISPR新技术助力HBV低病毒血症患者HBV DNA快速便捷检测

作者:肝病研究所 任锋 浏览次数:
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近期,首都医科大学附属北京佑安医院任锋教授科研团队在国际期刊《Emerging Microbes & Infections》(IF=19.568)发表了题为“CRISPR/Cas13a-assisted Rapid and Portable HBV DNA Detection for Low-Level Viremia Patients”的学术论文,该团队利用CRISPR/Cas13a检测新技术,联合等温扩增技术(RAA),建立了基于RAA-CRISPR/ Cas13a的HBV DNA快速、便携检测试纸条。为HBV感染者特别是HBV低病毒血症患者(LLV)的HBV DNA检测提供了一种可视化的、更快的替代方案。首都医科大学附属北京佑安医院博士研究生田原、范子豪和徐玲为本研究的共同第一作者,任锋教授、张向颖副教授和段钟平教授为共同通讯作者。

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世界卫生组织(WHO)制定了到2030年消除HBV作为公共卫生威胁的战略,其中主要目标之一就是提高HBV检测的效率和覆盖率。然而,在全世界超过2.5亿乙肝病毒(HBV)感染者中,95%以上的患者生活在低收入和中等收入国家,且仅有12-25%的患者符合诊断和抗HBV治疗的条件。此外,经过长期规范化的一线抗病毒药物治疗后,越来越多的患者被检测到血浆中持续或间歇性低水平的HBV DNA阳性,称为低水平病毒血症(LLV)。因此,本研究旨在推动HBV感染检测适应任何中小型实验室或现场调查,有效的提高HBV检测的效率和覆盖率。

成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关系统(Cas)作为一种新型的核酸检测技术,因其具有高灵敏度和高特异性的独特特性,在过去的十年中受到了广泛的关注并取得了很大的进展。CRISPR新技术被《Nature》认为可能是2022年7大“颠覆性”技术之一。2017年《Science》报道了美国麻省理工学院张峰团队首次将CRISPR-Cas13a检测技术与重组酶聚合酶扩增(RPA/RAA)技术相结合,建立新的核酸检测技术SHERLOCK,实现单拷贝、高特异性核酸检测方法。此外,CRISPR系统可利用侧流试纸条快速、便携的特点,无需专业人员即可实现病原核酸的高灵敏度、高特异性检测。目前针对HBV检测的试纸条主要依靠血清学标志物如乙肝表面抗原(HBsAg)等,而针对HBV DNA的即时检测(POCT)检测仍是空白领域。CRISPR/Cas检测——新兴的核酸分子诊断技术已经满足了试纸条的敏感性、特异性和低成本的要求,成为即时检测(POCT)的发展趋势。因此,侧流试纸条结合CRISPR/Cas技术可为HBV DNA的快速检测提供新的平台。

本研究利用CRISPR/Cas13a检测新技术联合RAA技术,建立了基于RAA-CRISPR/ Cas13a的HBV DNA的检测方法。通过对大约10000条HBV DNA序列比对,确定保守区序列,并基于此序列构建crRNA和RAA引物,完成了高特异性crRNA和RAA引物的筛选和验证,并对此申请了相关国家专利(202110200314.6)。其次,该方法可有效鉴定HBV DNA阳性质粒和临床样本,且灵敏度为101拷贝/μL,特异度为100%。同时,也对整个检测反应进程进行了相应的条件优化。因此,该研究成功有效地建立了一个HBV DNA的CRISPR/Cas13a检测系统。

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图1: 基于RAA-CRISPR/Cas13a检测HBV DNA体系的构建

本研究将基于RAA-CRISPR/ Cas13a系统与胶体金试纸结合使用,实现了快速、便携地HBV DNA检测。通过不同浓度的HBV阳性质粒和不同病毒载量的临床样本分别对该方法进行了验证。

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图2:“消线法”试纸条检测原理及不同浓度的HBV阳性质粒和不同病毒载量的临床样本验证

为评估CRISPR/Cas13a检测试纸条的有效性,选取HBV感染的LLV患者进行临床验证。通过对qPCR、CRISPR/Cas13a试纸条检测和CRISPR/Cas13a荧光检测三种方法的比较,CRISPR/Cas13a试纸条检测在LLV患者HBV DNA检测中的阳性符合率约为87%,阴性符合率为100%。

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图3:针对HBV感染的LLV患者的CRISPR/Cas13a试纸条检测

为进一步评估CRISPR/Cas13a检测试纸条的有效性,选取慢性乙型肝炎抗病毒治疗患者的动态血浆样本(111份),以增加临床样本数量进行验证。以qPCR为HBV DNA检测的标准,CRISPR/Cas13a试纸条检测抗病毒治疗患者动态样本中HBV DNA的灵敏度、特异度、阳性预测值(PPA)和阴性预测值(NPA)值分别为100%、92.15%、93.75%和100%。

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图4:HBV抗病毒治疗患者CRISPR/Cas13a试纸条检测HBV DNA分析

综上所述,这种快速便携的HBV DNA检测试纸条或其他类似检测方法将有望迅速扩大HBV感染的诊断筛查能力和覆盖面积,特别是LLV患者。此外,本研究为目前基于PCR的HBV感染诊断提供了一种可视化和更快的替代方案。这将简化HBV感染患者抗病毒治疗效果的验证过程,有助于解决HBV感染这一全球公共卫生问题。