近期，首都医科大学附属北京佑安医院任锋教授科研团队在国际期刊《Emerging Microbes & Infections》（IF=13.2）发表了题为“CRISPR/Cas13a-Assisted Accurate and Portable Hepatitis D Virus RNA Detection”的学术论文，该团队利用CRISPR/Cas13a检测新技术，联合等温扩增技术（RAA），建立了基于RT-PCR/RT-RAA-CRISPR/ Cas13a的HDV RNA快速、便携检测方法。该方法为监测HDV感染的发生发展和评价治疗效果提供了新的手段。首都医科大学附属北京佑安医院博士研究生田原、范子豪和张向颖副教授为本研究的共同第一作者，任锋教授和军事医学研究院李浩教授为共同通讯作者。

HDV是一种单股环形负链RNA病毒，由HBsAg外壳和HDV核心颗粒组成，核心颗粒包含1672~1697 个碱基。HDV是缺陷病毒，需要借助HBV来完成其生命周期。在全球普通人群中HDV的总患病率约为0.80%，在HBsAg携带者中HDV总患病率约为13.02%，相当于全球约有4800-6000万的HDV感染者。与其他型肝炎病毒感染比较，HDV感染进展速度更快，约70%丁型肝炎患者于5-10年内发展为肝硬化，15%的患者仅需1-2年即可进展为肝硬化。HDV/HBV合并感染者发生肝硬化和肝癌的风险较HBV单独感染者高。因此，本研究旨在建立一种精准便携的HDV核酸检测方法，为HDV感染的尽早发现和治疗提供帮助。

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关系统（Cas）作为一种新型的核酸检测技术，因其具有高灵敏度和高特异性的独特特性，在过去的十年中受到了广泛的关注并取得了很大的进展。CRISPR新技术被《Nature》认为可能是2022年7大“颠覆性”技术之一。2017年《Science》报道了美国麻省理工学院张峰团队首次将CRISPR-Cas13a检测技术与重组酶聚合酶扩增（RPA/RAA）技术相结合，建立新的核酸检测技术SHERLOCK，实现单拷贝、高特异性核酸检测方法。此外，CRISPR系统可利用侧流试纸条快速、便携的特点，无需专业人员即可实现病原核酸的高灵敏度、高特异性检测。目前针对HDV检测的试纸条主要依靠丁型肝炎病毒抗原抗体检测，而针对HDV RNA的即时检测（POCT）检测仍是空白领域。CRISPR/Cas检测——新兴的核酸分子诊断技术已经满足了试纸条的敏感性、特异性和低成本的要求，成为POCT的发展趋势。因此，侧流试纸条结合CRISPR/Cas技术可为HDV RNA的快速检测提供新的平台。

图1：基于CRISPR-Cas13a的HDV RNA检测原理示意图

本研究利用CRISPR/Cas13a检测新技术联合RT-PCR/RT-RAA技术，建立了RT-PCR/RT-RAA-CRISPR/Cas13a的HDV RNA的检测方法。通过对大约500条HDV基因序列比对，确定保守区序列，并基于此序列设计和筛选出了最佳的RT-RAA引物、RT-PCR引物和crRNA，并对此申请了相关国家专利（202311065728.8）。

图2：RT-RAA引物、RT-PCR引物和crRNA的设计和筛选

其次，该方法可有效鉴定HDV RNA阳性质粒和阳性临床样本，且灵敏度为1拷贝/μL。同时，也对整个检测反应进程进行了相应的条件优化。因此，该研究成功有效地建立了一个HDV RNA的CRISPR/Cas13a检测系统。

图3：使用合成HDV RNA阳性质粒评估RT-PCR-CRISPR和RT-RAA-CRISPR方法。

本研究将基于RT-RAA-CRISPR/ Cas13a系统与胶体金试纸结合使用，实现了快速、便携地HDV RNA检测。并通过HDV RNA阳性质粒和阳性临床样本分别对该方法进行了验证。

图4：HDV RNA的RT-RAA-CRISPR横向侧流试纸条检测

为进一步评估CRISPR/Cas13a检测方法的有效性，选取144例IgG阳性的临床血浆样本进行验证。分别用RT-qPCR、RT-ddPCR、RT-PCR-CRISPR荧光法和RT-RAA-CRISPR试纸条法进行比较。其中，RT-PCR-CRISPR荧光法的检测率（81.9%）和RT-RAA-CRISPR试纸条法的检出率（72.2%）均高于RT-qPCR（66.7%）和RT-ddPCR（76.4%）。

图5：IgG阳性患者的HDV RNA检测

综上所述，我们开发了新的RT-PCR-CRISPR荧光法和RT-RAA-CRISPR试纸条检测HDV RNA的方法，该方法不仅灵敏度高、特异性强，而且耗时少、操作方便。这项研究为监测疾病的发生和发展以及评估治疗效果提供了一个强有力的工具。